Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist eine komplexe Erkrankung der zentralen Netzhaut und die häufigste Erblindungsursache in den Industrieländern. Kenntnisse der genetischen Ursachen versprechen Einblicke in Stoffwechselwege der Erkrankung und bieten damit neue Zielstrukturen für therapeutische Interventionsmöglichkeiten. Ziel ist es, die molekularen Mechanismen der AMD Pathogenese aufzuklären. Hierbei konzentrieren wir uns auf einen Hauptgenort der AMD in 10q26, in dem wir 15 polymorphe Varianten im Bereich der Gene ARMS2 und HTRA1 mit hoher Signifikanz und starken Effekten für ein AMD Risiko identifizieren konnten. Diese Varianten werden auf ihre funktionelle Bedeutung in der AMD Pathogenese untersucht. Eine zentrale Rolle spielen dabei Analysen der Risiko- und Nichtrisiko-Varianten der beiden Gene in einer Reihe biochemischer und zellbiologischer Ansätze sowohl in zellulären als auch murinen in vivo Modellen. Parallel hierzu werden die regulären zellulären/extrazellulären Funktionen der beiden Gene in der Netzhaut aufgeklärt und Interaktionsnetzwerke beschrieben. Diese Arbeiten sollen die Entwicklung einer transgenen Mauslinie erlauben, um so ein valides Säugermodell der AMD Pathogenese zu generieren, das weitere vertiefende Untersuchungen in vivo ermöglicht und gleichzeitig innovative therapeutische Behandlungsansätze im Tiermodell  eröffnet.

Der größte Risikofaktor für den Tod retinaler Ganglienzellen beim primären Offenwinkelglaukom ist ein zu hoher Augeninnendruck, hervorgerufen durch einen erhöhten Abflusswiderstand für das Kammerwasser im Trabekelwerk. Die Filtration des Kammerwassers wird beeinflusst durch die extrazelluläre Matrix sowie die Kontraktilität der Trabekelwerkzellen, für die der RhoA/ROCK Signalweg und das Aktin-Zytoskelett eine wesentliche Rolle spielen. Der Umsatz von extrazellulärer Matrix und die Kontraktilität im Trabekelwerk werden moduliert durch den Connective Tissue Growth Factor (CTGF), der bei Überexpression ein Offenwinkelglaukom im Mausauge hervorruft. Wir werden den Phänotyp der von uns generierten Glaukom-Mäuse bis in ihr hohes Alter weiter charakterisieren und untersuchen, wie er durch eine Trabekelwerk-spezifische Defizienz des RhoA/ROCK Signalwegs beeinflusst wird. Wir werden analysieren, ob CTGF durch zellulären Stress im Trabekelwerk reguliert wird und ob mit höherem Alter das Trabekelwerk empfindlicher auf CTGF reagiert. Um die Bedeutung von CTGF für das normale Trabekelwerk zu studieren, werden wir Mäuse mit einer konditionellen Defizienz von CTGF im Trabekelwerk generieren und charakterisieren. Zur detaillierten Identifikation der von CTGF regulierten Gene werden wir Microarray-Analysen mit mRNA aus von uns entwickelten Trabekelwerkzelllinien mit CTGF-Überexpression oder Knockdown durchführen.

Bei hereditären Netzhautdystrophien kommt es durch apoptotische Degenerationsprozesse zu einem progressiven Verlust der Sehfähigkeit bis hin zur Erblindung. Befunde im Mausmodell der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (Rs1h^-/Y) deuten darauf hin, dass die Aktivierung von Mikroglia der retinalen Degeneration zeitlich voraus geht. In der degenerierenden Netzhaut treten simultan pro-inflammatorische und immundämpfende Mikrogliapopulationen auf. Das neu identifizierte Activated Microglia/Macrophage WAP Domain Protein (AMWAP) ist ein Marker und Effektor für anti-inflammatorische Mikrogliazellen. Ein ähnlicher gegenregulierender Phänotyp kann in vitro durch das Flavonoid Luteolin aus pro-inflammatorisch aktivierten Mikrogliazellen reprogrammiert werden. Diese Befunde sollen nun in vivo verifiziert werden, um den Effekt der Modulation von Mikroglia bei der Netzhautdegeneration zu evaluieren. Das erste Ziel des Antrags ist, durch gezielte Deaktivierung von Mikrogliazellen ihren funktionellen Beitrag an der Netzhautdegeneration in Rs1h^-/Y Mäusen aufzuklären. Dann sollen die Mikroglia-modulierenden Eigenschaften von Luteolin im Blaulicht-induzierten Lichtschaden in vivo untersucht werden. Weiterhin beschäftigen wir uns mit der Charakterisierung und in vivo Rolle von AMWAP als Mikroglia-Effektor. Die Ergebnisse des umfassenden Forschungsvorhabens sollen aufklären, welche Mikroglia-gerichteten Ansätze als Therapieoptionen bei Netzhautdegenerationen prinzipiell erfolgverprechend sind.

Glaukome, eine Gruppe von heterogenen Erkrankungen, bei denen es zur Degeneration der Axone von retinalen Ganglienzellen kommt, gehören weltweit zu den häufigsten Ursachen von Sehbehinderung und Erblindung. Ziel unseres Antrags ist es, die molekularen Mechanismen der Pathogenese von Glaukomen aufzuklären. Wir gehen davon aus, dass dies durch die Erforschung der Funktion von bei Glaukomen mutierten Genen und der von ihnen kodierten Proteine gelingen kann. Wir konzentrieren uns dabei auf die Moleküle Myocilin, Optineurin und WD Repeat Domain 36 Protein, welche bei Formen des primären Offenwinkelglaukoms mutiert sind, auf PAX6, das beim mit Aniridia assoziiertem juvenilen Glaukom mutiert ist, und auf Varianten von Lysyl Oxidase-like Protein 1, die mit dem Pseudoexfoliationssyndrom und –glaukom assoziiert sind. Wir haben zur Erforschung dieser Moleküle geeignete Tiermodelle entwickelt, deren Phänotyp wir strukturell und funktionell detailliert analysieren werden. Insbesondere werden wir testen, ob retinale Ganglienzellen bei Defizienz dieser Moleküle leichter einen Schaden durch einen erhöhten intraokulären Druck, den größten Risikofaktor des Glaukoms, erleiden. In einer Reihe von biochemischen und zellbiologischen Ansätzen in vitro und in vivo werden wir die Funktion der Moleküle weiter aufklären. Unsere Arbeiten sollen, neben einem tieferen Verständnis der molekularen Zusammenhänge bei Glaukomen, zur Entwicklung von kausalen therapeutischen Ansätzen wesentlich beitragen.

Mutationen im Bestrophin-1, einem integralen Membranprotein des retinalen Pigmentepithels (RPE), unterliegen ursächlich der zentralen Netzhautdystrophie Morbus Best. Initial wurde Bestrophin-1 als Ca²⁺-abhängiger Cl^- Kanal beschrieben, diese Funktion lässt sich in vivo bisher allerdings nicht bestätigen. Unsere Daten legen eine mögliche Rolle von Bestrophin-1 im intrazellulären Ca²⁺-Signalweg nahe. Hauptziel des hier beantragten Projekts ist es, die physiologische und pathophysiologische Rolle von Bestrophin-1 zu klären. Hierfür haben wir zwei murine Modelle mit entsprechenden Veränderungen im homologen Bestrophin-1 Gen der Maus generiert, die es uns erlauben, die Funktion von normalem und mutantem Bestrophin-1 im lebenden System zu untersuchen. Daneben benutzen wir porcine RPE Zellen mit einer hohen endogenen Bestrophin-1 Expression als ein wichtiges Zellkulturmodell. Mittels Immunpräzipitationen möchten wir das Netzwerk der Interaktionspartner von Bestrophin-1 aufklären. Daneben fokussieren wir uns in einem gerichteten Ansatz auf vielversprechende Kandidaten des Ca²⁺-Signalweges. Hierbei soll die Funktion von normalem und mutantem Bestrophin-1 durch Modulation von Ca²⁺-Kanälen und intrazellulären Ca²⁺-Speichern untersucht werden. Die komplementäre Vorgehensweise, die die Expertisen der beiden beteiligten Arbeitsgruppen optimal zusammen bringt, sollte es erlauben, ein funktionelles Modell der Mechanismen Bestrophin-1 vermittelter Zelldegeneration zu erarbeiten und damit die Voraussetzungen für Evidenz-basierte Interventionsmöglichkeiten am Tiermodell zu schaffen.

Norrin ist ein sezerniertes Signalprotein, das über den klassischen Wnt/β-Catenin Signalweg und Bindung an den frizzled-4 Rezeptor wirkt. Norrin und frizzled-4 sind in der Netzhaut Teile eines Signalsystems, das essentiell ist für die Ausbildung retinaler Kapillaren während der fetalen Entwicklung. In der vergangenen Förderperiode konnten wir zeigen, dass Norrin die Regeneration des Gefäßschadens nach einer Sauerstoff-induzierten Retinopathie im Modell der Retinopathia praematurorum der Maus signifikant verbessert. Zudem konnten wir eine neuroprotektive Wirkung von Norrin auf retinale Ganglienzellen nachweisen, die unabhängig von vaskulären Effekten erfolgt und mit einer Erhöhung der Expression von Leukemia Inhibitory Factor (LIF) und neuroprotektiven Faktoren in Müllerzellen einhergeht. Wir wollen nun den molekularen und zellulären Mechanismus der durch Norrin-vermittelten Gefäßregeneration und Neuroprotektion weiter aufklären und analysieren, welchen Einfluss der Wnt-/β-Cateninsignalweg und Norrin auf die Pathogenese der Retinopathia praematurorum und den Erhalt des adulten retinalen Gefäßsystem sowie auf retinale Ganglienzellen unter physiologischen Bedingungen und nach einer akuten Schädigung hat. Dabei sollen transgene Tiermodelle verwendet werden, die Norrin überexprimieren, Tiere, denen rekombinantes Norrin in den Glaskörper injiziert wird, bzw. Tiere mit einer konditionellen Deletion des Ndp und Ctnnb1 Gens. Eine Beteiligung von LIF an den durch Norrin-vermittelten Effekten werden wir mit Hilfe von LIF-defizienten Mäusen untersuchen.

Das beantragte Projekt will mittels funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRT) die neuroplastischen Vorgänge weiter aufklären, die bei Patienten mit Makuladystrophien durch das Optimieren des exzentrischen Sehens angestoßen werden. Während der ersten Förderperiode konnten wir zeigen, dass eine stabile exzentrische Fixation an einem bevorzugten Bereich der peripheren Retina (PRL – „preferred retinal locus“) zu funktioneller Reorganisation im visuellen Kortex zu Gunsten des PRL führt und dass Training zur Stabilisierung des PRL die neuroplastischen Reaktionen fördert. Unsere Hypothese ist daher, dass perzeptuelles Lernen (zur Unterscheidung feiner Details in Reizmustern) das Sehen am PRL noch weiter verbessern kann und den Patienten – besser als herkömmliche Lesetrainings - zusätzlichen Nutzen im Alltag bringen wird. Die Anpassungen des visuellen Kortex während dieser Lernvorgänge lassen sich mittels fMRT nachweisen. Weitere Schwerpunkte des Folgeantrags sind die Suche nach den neuronalen Korrelaten von Filling-In Phänomenen im zentralen Gesichtsfeld bei Makuladystrophie, sowie die Frage, welchen Beitrag die Stäbchen zum Sehen am PRL leisten. Dies kann durch Stimulation unter mesopischen Lichtverhältnissen mittels fMRT gezeigt werden. In der folgenden Förderperiode soll zudem das exzentrische Sehtraining für Patienten mit AMD fortgesetzt und erweitert werden.

Retinitis Pigmentosa (RP) umfasst eine genetisch heterogene Gruppe erblicher Netzhautdegenerationen, die zur Erblindung führen können. In Vorarbeiten haben wir durch Kandidatengen-Priorisierung mittels Cone-Rod Homeobox (CRX)-Chromatin-Immunpräzipitation und Ultrahochdurchsatz-Sequenzierung, Nullmutationen im FAM161A Gen als Ursache für autosomal rezessive RP (RP28) identifiziert. FAM161A wird stark in den Fotorezeptoren exprimiert. Der vorliegende Gemeinschaftsantrag vereint komplementäre Ansätze zweier Arbeitsgruppen zur effektiven Aufklärung der bisher unbekannten Funktion von FAM161A und der noch unverstandenen, molekularen Konsequenzen einer FAM161A Defizienz, die zur RP führen. Dies beinhaltet zum einen die zelluläre Feinlokalisierung des FAM161A Proteins sowie die Identifikation von Interaktionspartnern und deren molekulare Wechselwirkungen in den Fotorezeptoren mit proteinbiochemischen und zellbiologischen Methoden. Weiterhin werden retinale Fam161a Knockdown und Fam161a Knockout-Mausmodelle etabliert, um die direkten Auswirkungen einer FAM161A Defizienz auf die Fotorezeptorphysiologie zu untersuchen. Die Analyse der netzhautspezifischen Regulation von Fam161a rundet die umfassende Charakterisierung dieses neuen RP-Gens ab. Von der skizzierten Projektstrategie erwarten wir uns grundlegende Erkenntnisse über die Netzhautfunktion und neue Einblicke in die degenerativen Wirkmechanismen bei Retinitis Pigmentosa.

In der experimentellen Augenforschung spielen morphologische Untersuchungsmethoden eine eminent wichtige Rolle bei der Analyse von Phänotypveränderungen im Auge gentechnisch veränderter Mäuse und der Aufklärung der funktionellen Prozesse, die den Veränderungen zu Grunde liegen. Auch kann mit einer morphologischen Analyse die subzelluläre Lokalisation von Proteinen in Zellen und Geweben bestimmt werden, womit ein unverzichtbarer Bestandteil zu ihrer Funktionsanalyse geleistet wird. Bei gentechnisch veränderten Mäusen kann zudem die Struktur und Funktion der Netzhaut in vivo zuverlässig über die Methoden der Funduskopie, der optischen Kohärenztomographie (OCT) bzw. der elektroretinographischen Untersuchung (ERG) charakterisiert werden.Zur Sicherung einer hohen Qualität, der Vergleichbarkeit der Daten, sowie der Fokussierung und Optimierung von Ressourcen soll die Durchführung der morphologischen und elektrophysiologischen Methodik eingebettet werden in die vor Ort vorhandene Logistik und Spezialexpertise, und im Rahmen eines Zentralprojekts gebündelt werden. Aufgabe des Projekts ist die Beratung sowie personelle und sächliche Unterstützung bei einer möglichst breiten Palette von Untersuchungen.