Die drei Faktoren Licht, Fortschritt und Teamwork sind in unserem Gruppenlogo vereint: Licht (farbige Strahlen), welches von mehreren zusammen vereinten Teilen (Illustration eines Teams) abstrahlt, beleuchtet den Weg des Fortschritts (symbolisiert mit einem Pfeil).
Motivation
Enzyme sind die faszinierendsten molekularen Maschinen in der Zelle. Daher ist es von äußerstem Interesse ihre funktionalen Mechanismen im Feld der Enzymologie aufzuklären und ihre Funktion für unterschiedliche Anwendungen im Feld des Enzym Engineerings anzupassen. Um die wirksame raumzeitliche Kontrolle von Enzymaktivität zu ermöglichen, arbeiten wir mit lichtsensitiven unnatürlichen Aminosäuren (UAs), welche durch die Erweiterung des genetischen Codes mittels Amber-Suppression eingebaut werden. Unser übergeordnetes Forschungsziel ist es, diese UAs als synthetische Werkzeuge für die enzymologische Grundlagenforschung und das anwendungsorientierte Enzym Engineering zu nutzen und zugänglich zu machen (Abbildung 1). Die dabei generierten lichtsensitiven Enzyme nennen wir Photoxenasen.
Forschungsschwerpunkte
Enzymologie
In der Enzymologie sind vor allem photocaged UAs (Figure 1, unten) äußerst wertvoll für erweiterte Mutagenesestudien. Ihre sperrige Seitenkette ermöglicht es, andere Mutationseffekte als bei natürlichen Aminosäuren hervorzurufen. Noch wichtiger ist, dass sie sich bei Belichtung in natürliche Aminosäuren umwandeln, sodass die Regeneration von Wildtyp-ähnlichen Enzymen mit zeitlicher Auflösung untersucht werden kann, z. B. durch spektrometrische Methoden oder in X-ray Experimenten.
Tryptophan Synthase
Tryptophan-Synthase (TS) ist ein klassischer Multi-Enzym-Komplex, der ein Substrat/Produkt zwischen zwei Untereinheiten tunnelt. Bemerkenswert ist, dass die Reaktionen an den beiden aktiven Zentren der Untereinheiten TrpA und TrpB (Abbildung 2) streng allosterisch reguliert werden. Der Transport des Substrats/Produkts Indol und die allosterische Regulation sind dabei beide eng mit der sogenannten COMM-Domäne verbunden.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass sowohl der Indol-Transport als auch die allosterischen Ereignisse durch den Einbau der photocaged UA ONBY (Abbildung 1) [11] blockiert und durch lichtinduzierte Umwandlung in Tyrosin wiederhergestellt werden können. Mit diesem synthetischen Werkzeug wollen wir nun das Zusammenspiel von Konformationsänderungen, Indol-Transport und Katalyse zeitlich aufgelöst weiter untersuchen.
Photoxenase Engineering
Die raumzeitliche Kontrolle von Enzymen ist für verschiedenste Anwendungen von zunehmendem Interesse. Die Lichtkontrolle mit photocaged UAs (Abbildung 1, unten) ist unkompliziert und für vielfältige Anwendungen nützlich, insbesondere für die Kontrolle zellulärer Prozesse oder deren Visualisierung mittels kontrollierter Bildgebung [21] in der Zellforschung. Die irreversible lichtinduzierte „Entschützung” dieser UAs schränkt jedoch auch ihren Anwendungsbereich ein. Lichtschaltbare UAs (lsUAs; Abbildung 1, oben) ermöglichen stattdessen die reversible Kontrolle der Enzymaktivität durch einen lichtinduzierten Wechsel zwischen zwei Isomeren, was besonders für Anwendungen in der roten und weißen Biotechnologie wichtig ist.
Bemerkenswert ist, dass das Design von reversibler Lichtkontrolle bislang weitgehend eine Herausforderung darstellt. Wir treiben die Entwicklung der reversiblen Lichtkontrolle strategisch voran, indem wir schaltbare Photoxenasen entwickeln, verstehen und initial anwenden.
Entwicklung
Wir arbeiten kontinuierlich an den folgenden Herausforderungen, für die wir bereits erste Erfolge erzielen konnten [19, 20, 22, 23]:
- Welche Wechselwirkungen zwischen psUAA und dem Enzym sind für eine effiziente Photokontrolle vorteilhaft?
- Können wir die Effizienz der Photokontrolle steigern und wenn ja, mit welchen Strategien?
- Welche Anforderungen gelten für das zu verändernde Enzym sowie für die Einbauposition der psUAA?
- Können wir Engineering Strategien entwickeln, die universell oder zumindest für eine Untergruppe von Enzymen mit derselben Eigenschaft anwendbar sind?
- Ist es möglich, die Katalyse direkt zu steuern?
Untersuchung
Um eine Methode weiterzuentwickeln ist es unerlässlich die zugrundeliegenden Mechanismen zu verstehen. Unsere jüngsten Ergebnisse [19, 23], dass der reversiblen Lichtkontrolle eine Änderung in der konformellen Landschaft des Enzyms zugrunde liegt. Insbesondere interessieren wir uns für folgende Aspekte:
- Wird lichtinduziert die thermodynamische Stabilität der Enzymzustände und damit das Gleichgewicht oder die Zustände selbst und damit ihre Produktivität/Aktivität geändert?
- Wir erklärt sich unvollständige Reversibilität und wodurch wird sie verbessert?
- Beeinträchtigen die lichtinduzierten Änderungen nur einen Schritt im katalytischen Mechanismus oder mehrere?
- Wie funktioniert die Signalübertragung von der psUAA zum aktiven Zentrum?
Anwendung
Für die reversible Lichtkontrolle fokussieren wir uns besonders auf biotechnologische Anwendungen in der Biotherapie und der industriellen Biokatalyse.
Glutaminasen sind wichtige therapeutische Enzyme im Bereich der Antibiotika- und Chemotherapie-Forschung. Wir arbeiten vorwiegend mit der allosterischen Imidazol-Glycerinphosphat-Synthase [10, 12, 20, 23] sowie der bereits als Chemotherapeutikum etablierten Asparaginase-Glutaminase Typ II (Abbildung 6) [19].
Das Streben nach Nachhaltigkeit in der Industrie bedingt den immer häufiger werdenden Einsatz von Enzymen als Biokatalysatoren. Lichtkontrolle ist dabei attraktiv um auftretende Probleme, wie unterschiedliche Stabilitätshalbwertszeiten und Nebenreaktionen in Multienzymkaskaden, zu bewältigen. Unser Ziel ist die Lichtkontrolle von unterschiedlichen Enzymsystemen relevant für die Biokatalyse.
Genetic Code Expansion
Für den effizienten Einbau unserer lichtsensitiven UAs verwenden wir die Technologie zur Unterdrückung des TAG-Stoppons die in Abbildung 7 dargestellt ist. Eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-aaRS) wird für die Bindung der UA und deren Kopplung an eine orthogonale tRNA (O-tRNA) umgestaltet. Am Ribosom bindet das Anticodon der O-tRNA an ein umprogrammiertes Stoppcode, so dass die entstehende Proteinkette mit der UA reagieren kann. Das Ergebnis dieser umprogrammierten Proteinsynthese ist ein Protein, das eine UA an einer bestimmten Position trägt
Die Herstellung von Photoxenasen und Xenoptoteinen im Allgemeinen wird durch die hohen Kosten von (ps)UAAs aufgrund geringer Syntheseausbeuten und geringer Einbaueffizienzen stark eingeschränkt. In unseren jüngsten Projekten versuchen wir, diese Einschränkungen durch verschiedene Ansätze zu bewältigen.
