Unsere Forschungsmethoden

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat unsere Sicht auf die RNA-Biologie in einzelnen Zellen revolutioniert. 
Aktuelle Ansätze ermöglichen es, die Gesamt-RNA-Werte für Tausende von Genen in Zehn- oder sogar Hunderttausenden von Zellen zu profilieren. Die scRNA-seq hat jedoch eine inhärente Einschränkung: Jede Zelle kann nur einmal profiliert werden. 

Dies hat mehrere Folgen:
(i) Reaktionen auf Störungen können nicht direkt gemessen werden, (ii) die Kinetik der Transkription (z.B. Bursts) kann nicht untersucht werden, (iii) kurzfristige Veränderungen aufgrund einer Störung oder eines Reizes innerhalb weniger Stunden werden durch bereits bestehende RNA maskiert und (iv) Veränderungen in der RNA-Synthese und Zerfall können nicht unterschieden werden. 

Wir haben eine einzellige Thiol(SH)-verknüpfte Alkylierung für die metabolische Sequenzierung von RNA (scSLAM-seq (externer Link, öffnet neues Fenster)) entwickelt, die die metabolische RNA-Markierung, die biochemische Nukleosidkonvertierung und scRNA-seq integriert, um die transkriptionelle Aktivität in Einzelzellen direkt zu erfassen. Der Schlüssel dazu war ein neuer Computeransatz (GRAND-SLAM), (externer Link, öffnet neues Fenster) den wir kürzlich entwickelt haben und der es uns ermöglichte, das Neu-Zu-Gesamt-Verhältnis (NTR) für Tausende von Genen in einzelnen Zellen genau zu quantifizieren. Wir nutzten diese Methoden, um die früheren Veränderungen der Transkription bei infizierten Cytomegalovirus-Fibroblasten zu untersuchen. Anschließend entwickelten wir unsere computergestützten Werkzeuge und Methoden (großeR (externer Link, öffnet neues Fenster), grandRescue (externer Link, öffnet neues Fenster)) weiter.

Workflow von scSLAM-seq und GRAND-SLAM. 4sU in neue RNA integriert wird chemisch in ein Cytosinanalogon nach Zelllyse oder in festen Zellen umgewandelt. Die daraus resultierenden Missverhältnisse von scRNA-seq ermöglichen es, das neue bis totale RNA (NTR)-Verhältnis pro Gen/Zell mithilfe statistischer Modellierung abzuschätzen. Die Unterscheidung alter und neuer RNA ermöglicht Genregulationsnetzwerkinferenz, funktionelle Genomansätze und die direkte Analyse des transkriptionellen Burstens.

Ribosomenprofilierung (oder Ribo-seq) ist eine Technik zur Identifizierung und Quantifizierung der Übersetzung von ORFs mit Subcodon-Auflösung. 
Es basiert auf der Sequenzierung der Ribosomen-Fußabdrücke, die RNA-Fragmente sind, die durch das Ribosom vor enzymatischer Verdauung geschützt sind. Aufgrund der verwendeten strengen RNase-Bedingungen und der Tatsache, dass Ribosomen von Codon zu Codon translozieren, zeigen die Positionen der Sequenzierung eine charakteristische Periodizität in Bezug auf den Übersetzungsrahmen. Für viele liest man grob gesprochen, befindet sich das P-Site-Codon für das entsprechende Ribosom an Position 12 innerhalb des Lesens. 
Dieses Verfahren der Zuordnung von Karten liest sich auf P-Site-Codons ist jedoch zu ungenau, um viele ORFs, insbesondere die meisten kurzen Upstream-ORFs (uORFs), ordnungsgemäß aufzulösen. Wir haben die probabilistische Inferenz von Codon-Aktivitäten durch einen EM-Algorithmus (PRICE (externer Link, öffnet neues Fenster)) entwickelt, einen neuen Algorithmus zur Schätzung von P-Standort-Codon-Positionen mit drastisch verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus ermöglicht uns ein neuer statistischer Test, der in PRICE enthalten ist, komplexe Fälle wie die Beiläufigkeit mehrerer überlappender ORFs zuverlässig zu lösen. 
Die Validierung neu identifizierter ORFs ist bisher ein ungelöstes Problem. Da sie nach Translationspeptiden, die von kurzen ORFs abgeleitet sind, sofort abgebaut werden, entweichen sie häufig der Nachweis durch Massenspektrometrieexperimente. Wir argumentierten, dass sie in MHC-I-Komplexen gut vertreten sein sollten, da die Peptidpräsentation über diesen Weg von Translationsraten und nicht von der Proteinreichweite abhängt. In der Tat fanden wir Hunderte von kryptischen Peptiden, die aus kurzen ORFs in MHC-I-Ligandomexperimenten abgeleitet wurden.

Links: Vergleich von Ansätzen für die Zuordnung von Lesevorgängen zu Codons in Bezug auf Signal (Gesamtzahl der im Rahmen abgebildeten Lesevorgänge) und Signal-Rausch-Verhältnis (Lärm: liest out-of-frame-zu kommentierte ORFs). Farbcodiert nach dem Schlüssel, um eine deterministische Zuordnung von Leseklassen anzuzeigen, die durch Länge und 5' Fehlanpassungszustand und Kombinationen von Leseklassen definiert sind (grundlegende, ignorierende 5'-Mismatches; erweitert, unter Berücksichtigung von 5'-Missverhältnissen; Top 4, Kombination der besten Leseklassen) und probabilistischen Zuordnungen nach PREIS. 

Rechts: Gesamtmenge der Peptide, die in Proteom- und MHC-I-Peptidom-Massenspektrometrieexperimenten nachgewiesen wurden. Die 1% Peptid-Identifikation FDR ist durch eine gestrichelte Linie angezeigt. Graue Balken stellen die Peptide von ORFs dar, die auch durch ORF-RATER oder Rp-Bp (für PREIS) oder ORFs identifiziert wurden, die auch durch PRICE (für ORF-RATER und Rp-Bp) identifiziert wurden.

Viele Probleme in der Biologie können nur durch die Verwendung und Kombination von mehr als einem Datensatz aus groß angelegten Experimenten gelöst werden.

Durch die Integration mehrerer für microRNA-Targeting relevanter Datensätze (PAR-CLIP, Rip-Chip, LC-MS/MS, 4sU-Microarrays) haben wir beispielsweise gezeigt (externer Link, öffnet neues Fenster), dass virale und zelluläre microRNAs kontextabhängig an ihre Zielstellen binden und dass kontextabhängige Bindung kontextabhängige Auswirkungen auf die Genexpression hat. Interessanterweise stellten wir fest, dass dieser Kontext nicht durch das Vorhandensein von Abwesenheit von microRNA oder Target-mRNA erklärt werden kann, sondern dass andere Faktoren beteiligt sein müssen, die den Kontext ausmachen (z. B. Konkurrenz mit RNA-bindenden Proteinen oder stabilen RNA-Sekundärstrukturen).

Herpesvirale Genome sind relativ groß (z.B. ca. 150kb für HSV-1) und sind dafür bekannt, viele Proteine (z.B. 80 bekannte Proteine für HSV-1) zu kodieren. Seit der Verfügbarkeit von Genomsequenzen basierte die Identifizierung von Genen und Proteinen auf der Vorhersage von offenen Leserahmen (ORFs), die dann in den 1990er Jahren umfassend validiert und charakterisiert wurden. Moderne Hochdurchsatztechniken ermöglichen jedoch nun einen unvoreingenommeneren Ansatz, um genetische Elemente in solchen kleinen Genomen umfassend und genau zu identifizieren. Durch die Verwendung einer großen Auswahl an verschiedenen Datensätzen konnten wir die bisherige Anmerkung von HSV-1 (externer Link, öffnet neues Fenster) auf insgesamt 201 mRNAs und 284 ORFs erweitern (externer Link, öffnet neues Fenster). Es gab zwei sehr wichtige Lektionen zu lernen: Erstens könnte eine Entdeckung aus einem einzigen großformatigen Datensatz nur ein experimentelles Artefakt darstellen. Der Schlüssel, um genau zu sein, ist, mehr als eine experimentelle Technik zu integrieren. Und zweitens, um die Translation wirklich zu verstehen und welche Proteine hergestellt werden, ist das Wissen der mRNAs (und Transkriptionsstartstellen) unerlässlich.

Überblick über die angewandten Omics-Ansätze zur erneuten Annotierung von HSV-1. Die virale Genexpression wurde in primären humanen Fibroblasten (HFF) analysiert. Die Gesamtdaten der RNA-seq, 4sU-seq und Ribosomenprofilierung wurden kürzlich veröffentlicht. Um die Transkriptionsstartstelle (TiSS) umfassend zu identifizieren, führten wir cRNA-seq und dRNA-seq sowie RNA-seq auf subzellulären RNA-Fraktionen aus Mock-, Wildtyp- und diCP27-infizierten Zellen durch. Darüber hinaus haben wir kürzlich veröffentlichte PacBio- und MinION-Sequenzierungsdaten neu analysiert. Das Profiling der Translation Start Site (TaSS) wurde durch Ribosomenprofilierung nach Behandlung von Zellen für 30 min entweder mit Harringtonin oder Lactimidomycin durchgeführt. Die Proteomanalyse umfasste zwei ganze Proteomdatensätze mithilfe von SILAC und eine etikettenfreie Massenspektrometrie. Die verfügbaren Zeitpunkte und Bedingungen werden durch Sterne angezeigt.

Produkte von kurzen offenen Leserahmen werden nach der Übersetzung schnell degradiert. Daher haben sie die Möglichkeit, in den MHC-I Peptidpräsentationsweg einzutreten (siehe oben). Um die große Anzahl der verfügbaren Immunipeptidome-Datensätze überprüfen zu können, ohne Sequenzdatenbanken auf der Grundlage von Ribo-seq-Daten aufbauen zu müssen, haben wir den computergestützten Ansatz Proteogenomic Identification mithilfe von Stratified Mixture-Modellen (Peptide-PRISM) entwickelt. Peptid-PRISM identifizierte Tausende von kryptischen Peptiden und zeigte, dass kryptische Peptide tatsächlich bis zu 15% der MHC-I-Liganden in verschiedenen Tumorproben beitragen.

Peptid-PRISM identifiziert kryptische Peptide in einer Melanomprobe (A) Workflow von Peptide-PRISM. (B) Anzahl der für Probe MM15 identifizierten Peptide. Andromeda repräsentiert die ursprünglich veröffentlichten Zahlen, klassische FDR und Peptide-PRISM sind in den Methoden (C) beschrieben. Neuartige und kryptische Peptide bestehen aus dem gleichen Prozentsatz der von NetMHCpan 4.0 vorhergesagten HLA-I-Binder wie das veröffentlichte Peptid-Set. Neuartige Peptide sind proteombasierte Peptide, die durch unseren Ansatz identifiziert werden, aber nicht im ursprünglichen Bericht. Fehlerbalken stellen 95% Binomialkonfidenzintervalle dar.